Die Philosophie, die in den 1560er-Jahren an der Universität Salamanca gelehrt wurde, lehrte, der Geist sei anfangs leer: Er lerne nichts, es sei denn durch die Sinne. Johannes vom Kreuz studierte dort ab 1564, und von dieser Lehre ist er nie abgerückt. Im Aufstieg auf den Berg Karmel fasst er sie in ein Bild: Die Seele im Leib gleicht einem Gefangenen in einer dunklen Zelle, der nur kennt, was er durch deren Fenster sieht. Weist die Seele zurück, was die Sinne ihr bringen, bleibt sie im Dunkeln. Daraus zog Johannes den Schluss, der seine ganze Prosa durchzieht. Gott gehört nicht zu den Dingen, die durch die Fenster hereinkommen; wer Gott will, muss die Fenster also absichtlich schließen und im Dunkeln weitergehen.
Zur Vereinigung mit Gott, so lehrte er, gelangt man durch nichts, was der Geist sich vorstellen, erinnern oder erfassen kann, denn nichts Geschaffenes gleicht Gott. Die Seele muss deshalb leer werden – zuerst von ihrem Verlangen nach Dingen, dann vom Vertrauen auf ihren eigenen Verstand, ihr Gedächtnis und ihren Willen. Diese drei übergibt er dem Glauben, der Hoffnung und der Liebe. Auch Visionen und Offenbarungen müssen fort: Seine Leser sollen sie zurückweisen, selbst wenn sie von Gott kommen sollten. Diese Entleerung nennt er die Nacht. Die Trockenheit, die sie ins Gebet bringt, ist kein Grund zur Sorge, sondern ein Zeichen, dass die Seele auf dem Weg ist. Auf der Skizze eines Berges, die er für die von ihm geistlich begleiteten Nonnen zeichnete, trägt der gerade Pfad durch die Mitte die Aufschrift nada, nichts.
Er kam aus der Armut zu den Brüdern. Als Juan de Yepes geboren, verlor er 1545, mit etwa drei Jahren, seinen Vater Gonzalo. Gonzalos wohlhabendere Verwandte hatten ihn verstoßen, als er Catalina Álvarez heiratete, und er hatte an ihrer Seite als Weber gearbeitet. Die Familie ließ sich in Medina del Campo nieder, wo der Junge in einem Spital arbeitete und bei den Jesuiten lernte. 1563 trat er den Karmeliten bei, und als er 1567 zum Priester geweiht wurde, wollte er sie bereits für die Kartäuser verlassen, einen Orden von Einsiedlern, die in Schweigen leben. Im selben Jahr erzählte ihm Teresa von Ávila in Medina von ihrer Reform der Karmeliten und überredete ihn, sich stattdessen ihr anzuschließen. Am 28. November 1568 half er in Duruelo, ihr erstes Haus für Brüder zu eröffnen, und nahm den Namen Johannes vom Kreuz an.
Die Reform kostete ihn seine Freiheit. In der Nacht des 2. Dezember 1577 nahmen ihn Karmeliten, die gegen sie waren, in Ávila gefangen, wo er Beichtvater der Nonnen im Menschwerdungskloster war, und sperrten ihn in ihrem Kloster in Toledo ein. Fast ein Jahr lang hielt man ihn in einer Zelle von etwa drei mal zwei Metern fest und geißelte ihn vor der versammelten Gemeinschaft. Dort dichtete er im Kopf. Am 15. August 1578 gelang ihm die Flucht.
Gedichte und Lehre stehen in Spannung zueinander. Der Mann, der seinen Lesern auftrug, jedes Bild loszulassen, schrieb Liebesgedichte voller Bilder: eine Frau, die nachts aus einem schlafenden Haus schlüpft, eine Braut, die die Wälder fragt, wohin ihr Geliebter gegangen ist, eine Flamme, die verwundet. Seine vier großen Traktate sind Kommentare zu den eigenen Versen, in schlichter Prosa, gegliedert in Bücher, Kapitel und nummerierte Abschnitte. Im Prolog zum Geistlichen Gesang stellt er es jedem Leser frei, aus den Strophen zu nehmen, was der eigene Geist zulässt.
Im Juni 1591 enthob ihn ein Ordenskapitel in Madrid seiner Ämter. Er hatte sich Nicolás Doria widersetzt, der damals die Unbeschuhten Karmeliten leitete – den aus Teresas Reform hervorgegangenen Zweig –, und zwar in zwei Streitpunkten: beim Ausschluss von Jerónimo Gracián, Teresas engem Mitarbeiter, und in der Frage, ob man die Leitung der Nonnen aufgeben solle. Man schickte ihn in das abgelegene Kloster La Peñuela; er starb am 14. Dezember 1591 in Úbeda, mit neunundvierzig Jahren, ohne etwas veröffentlicht zu haben.
Die erste Ausgabe von Aufstieg auf den Berg Karmel, Die dunkle Nacht und Die lebendige Liebesflamme erschien 1618 in Alcalá, mit Stellen, die ihr Herausgeber, der Karmelit Diego de Jesús, abgeschwächt hatte. Keine fünf Jahre später fand sie die Inquisition von Sevilla in den Häusern mutmaßlicher alumbrados, geistlicher Kreise, denen man vorwarf, sich auf unmittelbare Eingebung durch Gott zu berufen; nachdem der Augustinertheologe Basilio Ponce de León 1623 die Vorwürfe widerlegt hatte, stellte der Inquisitionsrat in Madrid das Verfahren ein. Der Geistliche Gesang erschien 1622 auf Französisch in Paris und 1627 auf Spanisch in Brüssel. Seine kürzeren Stücke – Vorsichtsregeln, Briefe, Maximen und Gedichte – kamen in den zweiten Band der englischen Complete Works, die sein viktorianischer Übersetzer David Lewis 1864 herausgab.
1726 wurde er heiliggesprochen, 1926 zum Kirchenlehrer erhoben. T. S. Eliot stellte einen Satz aus dem Aufstieg an den Anfang von Sweeney Agonistes. Edith Stein, Philosophin und Karmelitin, schrieb gerade an Kreuzeswissenschaft, einer Studie über ihn zum vierhundertsten Geburtstag, als die Gestapo sie im August 1942 aus ihrem Kloster holte. 1948 verteidigte Karol Wojtyła, der spätere Papst Johannes Paul II., in Rom eine Doktorarbeit über die Glaubenslehre bei Johannes vom Kreuz.